آیا تا به حال با بازتولید تجربی مبارزه کرده اید؟ آیا به دنبال راه حلی برای حفظ شرایط پایدار کشت سلول هستید؟ پاسخ ممکن است در کنترل دقیق بافر HEPES باشد.HEPES (4- ((2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) یک ماده ی مهم و ضروری است که به طور گسترده در تحقیقات بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی مورد استفاده قرار می گیرد.، به دلیل توانایی خود در حفظ محدوده pH فیزیولوژیکی در فرهنگ سلول و واکنش های آنزیم شناخته شده است.
نقش حیاتی بافر HEPES
قبل از اینکه به روش های آماده سازی بپردازیم، درک اینکه چرا HEPES مواد بافر را در کار آزمایشگاهی حفظ می کند، ضروری است.این محلول شیمیایی ثبات pH را حفظ می کند - یک عامل حیاتی در آزمایشات بیولوژیکی که نوسانات کوچک pH می تواند به طور قابل توجهی بر نتایج تأثیر بگذارددر فرهنگ های سلولی، تغییرات pH بر رشد، متابولیسم و تمایز تاثیر می گذارد، در حالی که واکنش های آنزیماتیک برای فعالیت مطلوب به سطوح دقیق pH بستگی دارد.
در مقایسه با بافرهای سنتی فسفات، HEPES مزایای مشخصی را ارائه می دهد:
- ظرفیت بافری بالاتر در محدوده های PH فیزیولوژیکی
- سمیت سلولی پایین تر، آن را برای کاربردهای کشت سلولی ایده آل می کند
- هیچ باروری با یون های فلزی وجود ندارد، از بین بردن تداخل بالقوه با فعالیت آنزیم
پروتکل مرحله به مرحله برای آماده سازی بافر 1M HEPES
مواد مورد نیاز:
- HEPES (اسید آزاد): 119.15g
- آب تقطیر شده و یا آب دیونیزه شده
- NaOH (گوله های جامد)
- محلول متمرکز NaOH
- ظرف های مناسب (کوب ها، بطری های درجه بندی شده)
- اندازه گیری pH کالیبر شده
- مخلوط کننده یا مخلوط کننده مغناطیسی
- 0فیلترهای استریل 22μm
روش آماده سازی:
- 1محلول HEPES:119.15g HEPES را به حدود 400 میلی لیتر آب تقطیر شده در یک ظروف مناسب اضافه کنید. به طور مداوم تکان دهید تا محلول کامل رخ دهد، که منجر به یک محلول شفاف می شود.
- 2تنظیم pH اولیه:در حالی که مخلوط می شود، به تدریج گلوله های NaOH را به تدریج اضافه کنید تا pH به حدود 6 برسد.8. مراقب دقت با یک پی اچ متر برای جلوگیری از بیش از حد. توجه: این مرحله تولید گرما - با احتیاط دست.
- 3اندازه گیری دقیق pH:وقتی pH به 7 نزدیک می شود.0، به اضافه کردن قطره ای از محلول متمرکز NaOH تغییر دهید. ادامه دهید تا pH دقیقاً 7 به دست آید.0این فرآیند دقیق کیفیت بافر را تضمین می کند.
- 4تنظیم نهایی حجم:محلول را به یک کوسه حجم سنج 500 میلی لیتر منتقل کنید و با آب تقطیر شده به حجم برساند. به دقت مخلوط کنید تا یکسانی را تضمین کنید.
- 5تعقيم:محلول را از طریق یک غشا 0.22μm به ظروف استریل فیلتر کنید. این مرحله آلودگی میکروبی را از بین می برد و عمر شیلف را افزایش می دهد.
- 6. انبار:آب پاشی استریلی را به ظروف کوچک تر تقسیم کنید و در ۴ درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
ملاحظات مهم:
- برای جلوگیری از آلودگی از واکنشگرهای با پاکیزه ی بالا و آب استفاده کنید.
- کالیبراسیون pH نیاز به یک اندازه گیری استاندارد به درستی دارد
- برای نگهداری طولانی مدت فیلتراسیون استریل توصیه می شود.
- مقدار کمی از آلیکوات ها از کاهش کیفیت جلوگیری می کند
کاربرد در تحقیقات بیولوژیکی
بافر 1M HEPES در رشته های بیولوژیک به اهداف متعددی خدمت می کند:
کشت سلولی:pH مطلوب را در محیط رشد حفظ می کند و از تکثیر و عملکرد سلولی پشتیبانی می کند.
مطالعات آنزیم:شرایطی پایدار برای تحرک آنزیم و فعالیت آنزیم فراهم می کند.
کار با پروتئین:استخراج پروتئین، تصفیه و ذخیره سازی را در حالی که حفظ یکپارچگی ساختاری را تسهیل می کند.
تحقیقات اسید نوکلئونیک:از DNA و RNA در طول مراحل جداسازی و تجزیه و تحلیل محافظت می کند.
مطالعه موردی: افزایش نسخه برداری در آزمایشگاه
سیستم های نسخه برداری در بیوترو به شدت به ثبات pH برای فعالیت RNA پولیمراز بستگی دارد.تحقیقات نشان می دهد که واکنش های با بافر HEPES مقدار و کیفیت RNA بالاتر را در مقایسه با بافر های جایگزین به دست می آورندتوانایی ماده شیمیایی برای مقابله با محصولات جانبی اسیدی، شرایط آنزیم بهینه را حفظ می کند در حالی که RNA سنتز شده را از تجزیه محافظت می کند.
نتیجه گیری
آماده سازی بافر HEPES درجه آزمایشگاهی نیاز به توجه به جزئیات دارد اما پروتکل های ساده را دنبال می کند. با تسلط بر این تکنیک ها،محققان می توانند ثبات تجربی را در کاربردهای مختلف تضمین کنند.کنترل دقیق pH همچنان برای تولید نتایج علمی قابل اعتماد و قابل تکرار ضروری است.
